Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit Schutzmechanismen, die im Leitsystem des Phloems nach Applikation von mikrobiellen Elicitoren, so genannten Microbe-associated-molecular-patterns (MAMPs), zu finden sind. Konkret wurde ein potenzieller proteinvermittelter Siebelementverschluss der Versuchspflanzen Vicia faba und Cucurbita maxima nach flg22 (Flagellin) und glc8 (Chitin) Applikation untersucht. Im Phloem von Vicia faba, welche zur Familie der Fabaceae (Schmetterlingsblütler) zählen, existieren große spindelförmige Proteine, die bei einer Verletzung der Pflanze dispergieren. Diese Dispersion führt zu einem Verschluss der Siebelemente. Die phloemspezifischen Proteine in den Fabaceae heißen Forisome und beteiligen sich aktiv am Schutz der Pflanze (van Bel, A. J. E. et al. 2003). Das Ziel der Experimente an Vicia faba bestand darin, eine Reaktion der Forisome auf glc8 und flg22 zu überprüfen. Ebenfalls sollte ein Zusammenhang zwischen Lage und Position der Forisome im Siebelemente und der Reaktivität dokumentiert werden. In der Pflanze existieren verschiedene Arten von Abwehrreaktionen auf biotische Reize. Die systemische Route von Abwehrreaktionen verläuft vermutlich über das Phloem und wird vorwiegend über vorsorglich synthetisierte Substanzen, wie phloemspezifische Proteine (P-Proteine) organisiert. Daher liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit in der Untersuchung der proteinvermittelten Verschlussmechanismen im Phloem. Im Fokus der Arbeit stehen die physiologischen Veränderungen der Forisome in Vicia faba nach MAMP-Applikation. Ziel dieser Methode war es, eine Reaktion der Forisome auf MAMPs zu generieren und somit einen Beweis für eine Abwehrantwort der Pflanze zu erhalten. Durch die Versuche sollte gezeigt werden, das Forisome ebenfalls eine Reaktion der Pattern-Triggerd-Immunity (PTI) sind. Des Weiteren sollten auch die Phloem-Proteine PP1 und PP2 von Cucurbita maxima auf eine MAMP-Reaktion überprüft werden, die eine Abwehrreaktion der Pflanze auf MAMP-Applikation beweisen würde. Mit Hilfe dieser Untersuchungen sollte der Verschluss der Siebplatten identifiziert werden, um somit die Mechanismen des Verschlusses nach Befall zu verstehen.

Textprobe: Kapitel 6.1.1.3, Färbung des Phloems: Bei einer Einfärbung der Schnitte musste darauf geachtet werden, dass die Konzentration und die Inkubationszeit der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe optimal sind. Ebenfalls unterliegen die Farbstoffe unterschiedlichen Anwendungen. Die Versuchspflanzen wurden mit 5- und 6-carboxylfluorescein diacetate (CFDA), mit 5-chloromethyleosin diacetate/5-chloromethylfluorscein diacetate (CMEDA/CMFDA) und 4-amino-5-methylamino-2,7-difluorescein (DAF-FM) behandelt. Bevor die Farbstoffe aufgetragen wurden, musste zuerst der Schnitt ins intakte Phloem erfolgen. Der Farbstoff CFDA wurde über einen zusätzlichen Schnitt mittels Rasierklinge an der Blattspitze beladen. Auf die abgeschnittene Blattspitze wurde der Farbstoff CFDA in akropetaler Richtung aufgetragen. Die Inkubationszeit betrug etwa 60 bis 90 Minuten (Hafke, J. B. et al. 2005). CFDA wird als Marker für die Darstellung des symplasmatischen Transports eingesetzt, da dieser Farbstoff im Phloem mobil verlagert wird. CFDA strömt durch die Plasmamembran in basipetaler Richtung und akkumuliert in den Siebelement/Geleitzellen-Komplexen (SE/CC). Jedoch zeigt sich, dass sich der Farbstoff homogen im Siebelement verlagert, aber in den Geleitzellen stärker und auch gleichzeitig heterogener verteilt wird. Der Farbstoff wird nach ca. 20 bis 30 Minuten etwa 3 cm nach der Applikation basipetal in Richtung des Sichtfensters transportiert. Das eingefärbte Phloem wurde in vivo mittels KLSM beobachtet (Knoblauch, M. et al. 1998). Der Fluoreszenzfarbstoff CMEDA/CMFDA erfährt eine andere Anwendung als CFDA und wird direkt auf die Schnittstelle aufgetragen. Die Inkubationszeit betrug etwa 30 Minuten. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass zuerst der apoplasmatische Puffer von der Schnittstelle entfernt wird. Nach der Inkubationszeit wurde der Farbstoff wieder abgetragen und mit apoplasmatischem Puffer ersetzt. Somit sollte eine Überfärbung der Schnittstelle verhindert werden. Dieser Farbstoff wurde eingesetzt, um die Forisome besser hervorzuheben und eine Reaktion der Forisome besser zu veranschaulichen (Furch, A. C. U. et al. 2007). Als weiterer Farbstoff wurde DAF-FM eingesetzt. Bei diesem Farbstoff wurde die gleiche Applikation durchgeführt wie bei CMEDA/CMFDA, denn anders als CFDA wird auch DAF-FM direkt auf die Schnittstelle appliziert. Der Farbstoff hatte eine Einwirkzeit von etwa 30 Minuten. Der Farbstoff ist ein Indikator für die Stickoxid-Produktion (NO-Produktion) im Phloem. Ebenfalls fluoresziert der Farbstoff erst dann, wenn es zu einer Reaktion mit NO kommt. Erst mithilfe eines Reizes wird die NO-Produktion ausgelöst (Gaupels, F. et al. 2008). Nach dem Auftragen der Farbstoffe CFDA, CMEDA/CMFDA oder DAF-FM wurde die Pflanze, wie oben beschrieben, mit flg22 behandelt. Die Zugabe des MAMPs (flg22) erfolgte direkt auf die Schnittstelle. Daraufhin wurde die Konformationsänderung der Forisome und eine Veränderung der Farbstoffintensität im Phloem beobachtet und mittels Leica Konfocal Software aufgenommen. 6.2, Probenentnahme von Cucurbita maxima: Die Cucurbita maxima-Pflanzen wurden vor der Probenentnahme mit flg22 behandelt, dessen Konzentration 1,25 µM betrug. Hierbei wurden 100 µl flg22 2 cm vom Spreitengrund des Blatts infiltriert. Die Kontrollpflanzen wurden mit 100 µl H2O auf die gleiche Weise behandelt. Bei der Entnahme des Phloemsafts wurden verschiedene Zeitpunkte eingehalten (t = 10 Minuten bis t = 5 Stunden). Bei der Probenentnahme (Abb. 5) wurde das zweite Blatt oberhalb der Kotyledone (Petiole) mithilfe einer Rasierklinge abgeschnitten. Nach dem Schnitt wurde mit einem saugfähigen Tuch der erste ausströmende Phloemsaft abgetupft, um potenzielle Verunreinigungen (Zellbestandteile) zu entfernen. Erst nach diesem Schritt wurde der Phloemsaft (1 µl) mit einer Pipette entnommen.

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