- Sie befinden sich:
- Specials
- »
- Bachelor + Master Publishing
- »
- Naturwissenschaften
- »
- Biogenese chloroplastidärer Proteinkomplexe am Beispiel der Gerste mit Hilfe der 2-D-Gelelektrophorese
Naturwissenschaften
» Blick ins Buch
» weitere Bücher zum Thema
» Buch empfehlen
» Buch bewerten Produktart: Buch
Verlag: Bachelor + Master Publishing
Erscheinungsdatum: 02.2011
AuflagenNr.: 1
Seiten: 70
Abb.: 24
Sprache: Deutsch
Einband: Paperback
Diese Arbeit veranschaulicht am Beispiel der Gerste die Herangehensweise und Durchführung von Versuchen zur Untersuchung chloroplastidärer Proteinkomplexe mit Hilfe der 2D-Gelelektrophorese und deren Auswertung. Die in den Versuchen gewonnenen Daten wurden im zeitlichen Verlauf während der Ergrünung betrachtet. Für den Forscher lassen sich daraus Informationen für die Arbeit mit plastidären Proteinen, deren Biogenese und Kinetik der Proteinassemblierung ableiten. Neben der Anleitung zu Pflanzenzucht und Belichtung werden auch die Isolierung von Mitochondrien, Etioplasten und Chloroplasten detailliert beschrieben. Dabei wurde viel Wert auf die Nachvollziehbarkeit der dargestellten Methoden gelegt. Verschiedene biochemische Trennverfahren werden kurz erläutert und die Gelelektrophorese als eine geeignete Methode zur Auftrennung von Proteinen dargestellt. Es wird auf Varianten der Gelelektrophorese und deren Modifikationen für besondere Anforderungen eingegangen, wie z.B. diskontinuierliche Elektrophoresen und Gradientengele, aber auch denaturierende Elektrophoresen, wie die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und die Tricin-SDS-PAGE für eine optimale Auflösung im niedermolekularen Bereich. Besondere Beachtung wird der Blau-Nativen PAGE geschenkt, mit der es gelingt Proteine nativ aufzutrennen, um so vollständige Proteinkomplexe wie Photosysteme und Cytochrome zu unterscheiden und zu identifizieren. Durch Kombination dieser Technik mit der Tricin-SDS-PAGE als zweite Geldimension wird eine 2D-Gelelektrophorese vorgestellt, welche ein Auftrennen einzelner Proteine nach verschiedenen Kriterien erlaubt. Mit der Darstellung der Gele und deren Auswertung konnten Proteine und Proteinkomplexe identifiziert werden und die Veränderung des Proteinmusters während der Ergrünung der Gerste wurde deutlich. Ein anschließender Vergleich der Daten mit der Literatur lässt weitere Interpretationen zu.
Textprobe: Kapitel 1.3, Grundlagen zur Analyse chloroplastidärer Proteinkomplexe: Chlorophyll und die anderen Pigmente sind proteingebunden und können nur als Protein-Chlorophyll (bzw. Protein-Pigment)-Komplexe aktiv sein. Das Studium der Proteine, die für die Photosynthese essentiell sind, setzte erst sehr spät ein. Die Ursache dafür liegt darin, dass es sich durchweg um membrangebundene Proteine handelt, deren Isolierung und Charakterisierung mit den klassischen Methoden der Proteinanalyse kaum oder gar nicht gelang. Die chromatographisch aufgetrennten - und somit isolierten - Pigmente sind für sich alleine genommen für die Photosynthese wertlos. Die Pigment-Protein-Komplexe, die meisten Proteine der Elektronentransportketten sowie die ATP-Synthetase, sind integrale Bestandteile der Thylakoidmembran Die Positionen in der Membran, und die relative Anordnung der Proteine zueinander sind die wichtigsten Voraussetzungen für die Energieumwandlung. Erst nach Entwicklung empfindlicher Verfahren, wie der Gelelektrophorese und dem kontrollierten Einsatz von Detergentien (z.B. Natriumdodecylsulfat: SDS), wurde es möglich, die Proteine aufzutrennen und zumindest als Banden in einem Gel zu identifizieren. Weiterhin können durch dieses Analyseverfahren die Molekulargewichte der jeweiligen Polypeptidketten bestimmt werden. Ein zweiter, hiervon unabhängiger Ansatz ist die Verwendung spezifischer Sonden, z.B. fluoreszenzmarkierter Antikörper. Durch Einsatz der Gefrierätztechnik ist es so möglich, zu entscheiden, ob ein bestimmtes Protein oder ein Teil einer Polypeptidkette an der Innen- oder der Außenseite einer Membran exponiert ist. Mit Antikörpern gegen bestimmte Proteine gelingt es, das betreffende Protein aus einem Proteingemisch selektiv auszufällen, weil nur dieses den hochspezifischen Antigen-Antikörper-Komplex ausbilden kann. Die Gelelektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, bei der die Wanderung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld zu deren Trennung ausgenutzt wird. Elektrophorese von Proteinen wird in einer elektrisch neutralen, festen Gelmatrix aus Polyacrylamid durchgeführt. Die aufgetrennten Proteine erscheinen nach der Elektrophorese und ihrer Färbung als Banden. Das Wanderungsverhalten von Proteinen in den Gelen hängt von der Stärke des angelegten elektrischen Feldes, Größe und Form der Proteine sowie der Ionenstärke, der Porengröße und der Temperatur des Gels ab. Die Gele wirken aufgrund ihrer Porengröße wie Molekularsiebe,welche die Wanderung größerer Proteine verlangsamen oder vollständig blockieren, während kleinere Proteine ungehindert durch die Matrix wandern. Die Porengröße bei Acrylamidgelen wird von der Acrylamidkonzentration und vom Vernetzungsgrad bestimmt der durch die Bisacrylamidkonzentration im Gel festgelegt wird. Die Zusammensetzung des Gels aus Acrylamid und Bisacrylamid wird mit den Parametern T und C in Prozent angegeben. Dabei steht der T- Wert für die Konzentrationen an Acrylamid und Bisacrylamid. Der C Wert gibt das Verhältnis von Bisacrylamid zur Gesamtmenge von Acrylamid und Bisacrylamid an. Die Polymerisation wird durch freie Radikale gestartet, normalerweise durch das APS/TEMEDSystem. APS (Ammoniumpersulfat) zerfällt in wässriger Lösung spontan in ein Persulfatradikal, welches TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin) aktiviert. Dieses wiederum aktiviert die Monomere, in- dem es ein Elektron überträgt. Eine Verbesserung der Auflösung der Proteinbanden kann durch Verwendung von sog. Gradientengelen erreicht werden, bei denen sich die Porengröße innerhalb der Gelmatrix linear oder exponentiell verändert. Ein Problem ist, dass die Proben ein merkliches Volumen haben und infolge der apparativen Gegebenheiten die aufgetragenen Zonen durch ihre Breite die hohe Auflösung vermindern. Das kann durch Verwendung von diskontinuierlichen Elektrophoresen verhindert werden. Dabei besteht das Polyacrylamidgel aus zwei Gelen unterschiedlicher Konzentration und unterschiedlicher Pufferung. Eine diskontinuierliche Elektrophorese kann die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDSPAGE) sein. Die Proteine werden hierbei in Gegenwart eines Überschusses von Natriumdodecylsulfat (SDS) elektrophoretisch aufgetrennt. Das negativ geladene SDS lagert sich an die Proteine an und bringt soviel Ladung mit, dass die Eigenladungen der Proteine keine Rolle mehr spielen und alle Proteine zur Anode wandern. Gleichzeitig werden die Proteine denaturiert und wandern im Gel daher entsprechend ihres Molekulargewichtes. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine verhält sich dabei annähernd umgekehrt proportional zum dekadischen Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Das gebräuchlichste SDS-Gelsystem ist das Laemmli-System. Die Proteine werden im Sammelgel zu einer schmalen Bande aufkonzentriert. Für diesen Vorgang sind die im Laufpuffer vorhandene Glycin und Chloridionen verantwortlich. Unterhalb von pH 9 liegt Glycin fast nur als Zwitterion, d.h. in elektrisch neutraler Form vor und seine Mobilität ist gering. Dagegen ist die Mobilität der Chloridionen höher, die Mobilität der Proteinionen liegt dazwischen. Chloridionen wandern schneller zur Anode als Glycin und es entsteht ein lokaler Abfall in der Ionenkonzentration. Dies bewirkt ein Abfall der Leitfähigkeit. Da jedoch der Stromfluss überall gleich groß sein muss, steigt die Spannung und die langsamen Ionen werden beschleunigt. Treten sie dagegen in den Chloridbereich ein, so werden sie verlangsamt. Die Folge ist Konzentration aller Proben im Bereich ihrer Mobilität. Durch eine niedrige Polyacrylamidkonzentration im Sammelgel wird der Molekularsiebeffekt zum größten Teil verhindert. Im Trenngel bilden sich dann aufgrund des höheren pH mehr Glycinanionen. Die Mobilität von Glycin steigt und es überholt die Proteine, welche durch den Molekularsiebeffekt aufgetrennt werden. Es bilden sich feine und scharfe Banden. Die Variante nach Schägger und v. Jagow, die sog. Tricin-SDS-PAGE, ergibt eine weiter verbesserte Auflösung im niedermolekularen Bereich durch die Verwendung von Tricin statt Glycin. Da die Mobilität von Tricin relativ unabhängig vom pH ist, unterscheiden sich Sammel- und Trenngel in diesem System nicht voneinander. Tricin wandert im Sammelgel etwas schneller als Glycin, da Tricin unter den üblichen pH-Bedingungen (pH 6,8 - 8,8) in ionischer Form vorliegt. Dies hat zur Folge, dass sich die Proteine mit niedrigeren Molekulargewichten besser an der Salzfront im Sammelgel anordnen.
Anja Karolewiez, Diplom-Biologin, wurde 1973 in Mannheim geboren. Während des Studiums der Chemie und Biologie an der Fridericiana Universität Karlsruhe (TH) mit den Schwerpunkten Genetik, Botanik, Mikrobiologie und organische Chemie belegte die Autorin zusätzliche Veranstaltungen in Meeresbiologie, Paläontologie und Geologie. Nach dem Abschluss als Diplom-Biologin im Jahr 2002 arbeitete sie auf verschiedenen Projekten an Forschungseinrichtungen und erwarb so Kenntnisse im Bereich der angewandte Mikrobiologie, angewandte Bioinformatik, molekulare Mykologie, botanische Zytologie und Molekularbiologie, wie DNA-basierte Populationsanalysen, quantitative Genexpressionsanalysen und Proteinexpressionsanalysen. Zurzeit ist sie als freiberufliche Fachbuchautorin tätig.
weitere Bücher zum Thema
![zurück zurück](grafik/bild_weitere_zurueck.gif)
What are the potential causes of incorrect predictions of tropical cyclone intensification in medium-range ensemble forecasts?
ISBN: 978-3-95993-113-7
EUR 29,90
Public-Key Verschlüsselung von der LPN-Annahme
ISBN: 978-3-95993-016-1
EUR 19,99
Untersuchungen zur Diversität larvaler Trichoptera-Artengemeinschaften im Speyerbach bei Neustadt (Pfalz)
ISBN: 978-3-95820-334-1
EUR 24,99
Förderung des entdeckenden Lernens durch den Einsatz dynamischer Geometrie-Software: Am Beispiel des Themas "Umkreis von Dreiecken"
ISBN: 978-3-95820-269-6
EUR 24,99
Gibt es Lockerbraunerden im Nordschwarzwald?
ISBN: 978-3-95820-288-7
EUR 24,99
Mindestkapitalanforderung für ein Kreditportfolio im Rahmen eines stochastischen Modells mit integriertem Markt- und Kreditrisiko
ISBN: 978-3-95820-252-8
EUR 24,99
Mathematisches Modellieren in der Grundschule: Darstellung von Modellierungskompetenzen an ausgewählten realitätsbezogenen Aufgabenstellungen
ISBN: 978-3-95820-174-3
EUR 24,99
Bedeutung von Blutbestandteilen für die Funktion des Zentralnervensystems des Blutegels
ISBN: 978-3-95820-138-5
EUR 24,99
Exkursionsführer zur Geologie Thüringens: Ein Querschnitt von Nord bis Süd
ISBN: 978-3-95684-382-2
EUR 14,90
Binnendifferenzierte Lernumgebung: Lernstationen im Biologieunterricht
ISBN: 978-3-95684-307-5
EUR 44,99
![vor vor](grafik/bild_weitere_vor.gif)